2023年10月28日，兰州大学生命科学学院向云课题组在Cell Reports发表了题为“The Arabidopsis GPI-anchored protein COBL11 is necessary for regulating pollen tube integrity”的研究论文，发现了拟南芥COBRA-LIKE 11直接调节配体小肽RALF4和受体激酶ANX1的正确定位和极性分布，从而维持花粉管的完整性。
双受精是被子植物有性生殖过程中的关键生理活动。在此过程中，花粉管的完整性需要被精准调控：为了将精细胞输送到雌配子体，花粉管在穿过雌蕊各种组织顺利到达胚囊前需要维持完整性，当花粉管识别雌配子产生的信号后需要及时爆破，才能快速释放精细胞。因此，花粉管的完整性对于完成双受精至关重要。RALF4/19-ANX1/2-BUPS1/2复合体介导的信号通路在维持花粉管完整性方面起着至关重要的作用，但调控这些复合物成员在花粉管顶端极性定位和分布的潜在机制仍不清楚。植物糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（Glycosylphos-phatidylinositol-anchored protein, GPI-AP）是一类定位于细胞膜外表面的膜蛋白，参与调节多种重要的生物学过程。COBRA家族是一类植物特异性的GPI锚定蛋白，据报道该家族成员参与调控重要的生物活动，如根毛的起始和生长、盐胁迫和干旱胁迫、花粉管的导向、植物的生长和发育等。目前有关COBRA家族成员在花粉管完整性方面的研究还未见报道。
该课题组通过正向遗传学筛选和反向遗传学验证，发现了拟南芥GPI锚定蛋白COBRA家族成员COBL11功能缺失导致花粉萌发率降低、花粉管提前破裂，以及种子部分败育。
图1. COBL11功能缺失导致花粉管完整性严重受损，轻度雄性不育
(A)野生型（Col-0）、cobl11突变体和 pCOBL11-COBL11-GFP 回补株系 COM-3 # 和 COM-6 # 的花粉管萌发和离体生长。(B）量化（A）中未萌发花粉、爆裂花粉管（PT）和正常花粉管的比率。(C) 自交 Col-0、cobl11突变体和回补株系的种子数。 (D）限制性授粉 10 天后具有代表性的开放的角果。 (E、F）对（C）和（D）中每个角果中的种子数进行统计分析。(G）Col-0 和 cobl11 的限量 20 个花粉粒给 Col-0 柱头授粉7 小时后对雌蕊进行苯胺蓝染色。白色箭头表示花粉管生长的前端，红色箭头标记破裂的花粉管。
向云教授课题组通过DUAL membrane yeast two-hybrid (Y2H)、Pull-down、花粉管BiFC等实验发现COBL11与RALF4/19以及ANX1/2和BUPS1/2的胞外近膜域相互作用。同时，COBL11功能缺失导致RALF4在花粉管顶端分布明显减少，并在柄部无序聚集；受体激酶ANX1的极性定位也被破坏，表现出向花粉管顶端质膜和细胞质大量聚集。一系列药理学实验证明COBL11可能通过内膜运输途径影响RALF4/ANX1复合体成员的极性分布。上述数据表明，COBL11通过与花粉管顶端和细胞质中的RALFs-ANXs-BUPSs成员相互作用，以及直接参与RALF4和ANX1在花粉管中的运输，维持其准确定位和极性分布。花粉管顶端RALFs-ANXs-BUPSs复合体的稳态和信号转导受到细胞内不同关键蛋白的协同调控，因此得以在极性生长过程中维持完整性。
图 2. COBL11 功能缺失会影响 RALF4 和 ANX1 在花粉管中的极性定位
(A) Col-0和cobl11突变体中萌发花粉粒（上图）和生长花粉管（下图）RALF4-GFP 定位的共聚焦图像。(B) 对顶端区域（a）45 分钟内、顶端区域（b）和顶端胞质区域（c）3 小时内 RALF4-GFP 的相对荧光强度进行定量分析。(C) Col-0 和cobl11突变体中 ANX1-GFP 的发芽花粉粒（上图）或生长花粉管（下图）定位的代表性共焦图像 (D）定量分析（E）中标记的 45 分钟内 ANX1-GFP 在顶端区域（a）、顶端 质膜（b）、顶端胞质（c）、亚顶端 PM（d）和亚顶端细胞质（e）中的相对荧光强度。(E）定量数据示意图。(F）FlTC 标记的 RALF4 小肽与 Col-0 和 cobl11 生长的花粉管的结合图像。(G）定量分析（E）中b和e区域中 FITC-RALF4 的相对荧光强度。
图 3. COBL11调控花粉管完整性模型图
兰州大学生命科学学院和细胞活动与逆境适应教育部重点实验室的黎红霞博士和杨洋博士后为论文共同第一作者，向云教授为通讯作者。北京师范大学任海云教授和杜平州助理研究员对该研究提供了大力支持。张宏凯硕士和李承瑛博士、毕萌萌博士、陈涛博士、青年研究员钱东、牛月副教授和安黎哲教授也参与了该研究。该研究得到国家自然科学基金、海南崖州湾种子实验室、兰州大学中央高校基本科研业务费的资助。
